English
KONSTRUKTION AF RHODODENDRONFAMILIENS STAMTRÆ I
FRA RHODO-NYT 1996(4)
Forskning indenfor rhododendronfamiliens stamtræ er nu gået ind i en ny æra,
idet DNA teknologiens metoder indføres.
Hvis vi går ca. 80-100 år tilbage i tiden indsamledes mange nye arter i
Himalaya af plantejægerne Veitch (1900-04), Forest (1910,1912-4,1917-9,1924-
5...), Kingdon-Ward (1913-..), Rock (1923-..) osv. Der blev herved hjembragt
enorme mængder frø, som blev indført til England og sået. Desuden blev der
presset herbariummaterialer til senere studier. Disse ekspeditioner har
været utroligt værdifulde for eftertidens forskere, gartnere, plantesamlere
og haveejere.
Forskere har siden forsøgt at artsbestemme materialet ved at konstruere
bestemmelsesnøgler til at gruppere arterne til forskellige familier,
slægter, serier og underserier. Dette arbejde har været særdeles vanskeligt,
især fordi det indsamlede materiale indeholdt planter der kun varierede lidt
fra hinanden, men dog med enkelte karakteristiske forskelle. Desuden var der
planter, som siden hen viste sig at være hybrider.
For at karakterisere en art vil det ideelle være at finde et enkelt 100%
sikkert kriterium, men af mangel på dette opstillede botanikerne måske ca.
8-10 kriterier efter bedste evne. Hvis en plante så har ca. 80%? af disse
karakteristika vil bestemmelsen sikkert i orden. Imidlertid er nogle "arter"
kun karakteriseret med få usikre kendetegn såsom "fordeling af hår" eller
bladets form og vægtningen af disse er usikre og lidet undersøgte.
Linné‚ fandt ud af at især blomstens opbygning (kurv-,ærte,-maske-, læbe-
osv.) var særdeles anvendelig som kendetegn for en art der skal henføres til
en familie. Dette skyldes at især blomstens opbygning og udseende konstant
har haft betydning for plantens overlevelsesevne, på grund af samspillet/
specialisering der er mellem planter og insekter/fugle mht. bestøvningen og
nektar/pollen. For at kunne lave denne specialiserede og komplicerede blomst
har det været nødvendigt at mange gener har kunnet samarbejde indbyrdes for
at opnå disse forhold.
Andre komplicerede egenskaber betyder måske mindre når en plante skal
artsbestemmes f.eks. egenskaben som regulering af vakst og vandbalance. Dette
skyldes at mange arter fra forskellige slægter allerede har løst problemerne
på samme måde, idet det har været en forudsætning for liv hurtigt at kunne
tilpasse sig varierende omgivelser f.eks. til at modstå frost og skadedyr.
Disse egenskaber er desuden svære at bruge i en bestemmelsesnøgle.
Gode kendetegn indenfor Rhododendron til at adskille familierne har netop
vist sig at være de strukturer der er komplicerede opbyggede (styret at
mange gener), medens underfamilier/serier adskilles af træk der er mindre
sammensatte, medens egenskaber der kun styres af e'et gen er ofte helt
ubrugelige til andet end beskrivelse af en varianter indenfor en art.
Eksempler på komplicerede egenskaber har været svære at finde hvis de ikke
unders›ges med genetiske metoder dvs. (nedarvningsundersøgelser) og alt andet
er kun gætteri: blomstens placering på stilken, udformning af bæger og
kronblade, støvvej, indument og hårtype.
Eksempler på egenskaber der er styret af e'et eller få gener: klistrede
knopper, farvenuancer i knopper, blade og blomster.
længde og bredde af blade og gener der regulerer fordeling af hårbeklædning.
Disse morfologiske (bygningsforskelle) usikre kendetegn har været anvendt
til at gruppere planterne i arter. Arterne i underserier. Underserier i
serier osv.
For at opbygge et stamtræ sættes de mest primitive familier nederst
(stammen), derover serierne (hovedgrene), subserier (grene), ..arterne de
yderste grene (og varianterne er bladene).
Dette stamtræ håber man på svarer til udviklingen af Rhododendron slægten
gennem tiderne fra de simpleste former (med få komplicerede træk, R.
camtschaticum ?) til de mere komplicerede former (Falkoneri serien ?).
Forskerne har endnu ikke kunnet lavet dette stamtræ og de har endnu ikke
været enige om hvilke arter, der skal indgå i serierne eller om en
plantegruppe tilhører en art, hybrid eller variant.
Nu er der imidlertid hjælp at hente gennem den moderne genteknologi, som
svarer til kulstof-14 metoden for arkæologer.
Ved at betragte sikre kendetegn som forskelle i DNA sekvensen
(bogstavombytninger) kan man bestemme slægtskab og aldersforskelle mellem
arter og familier indbyrdes (phylogenetik).
DNA molekylet er det arvelige materiale, der indeholder 4 forskellige kemiske
bogstaver kaldet A,T,G,C. De 4 bogstaver sidder i forskellig rækkefølge. Et
DNA molekyle består ofte af måske 1000.000.000 bogstaver og er spiraliseret,
op til et kromosom. Et sådant kromosom kan også opdeles i måske 10.000 gener
på hver ca. 500-50.000 bogstaver (5% af bogstaverne ligger i generne)
Molekulærgenetikere er nu blevet enige om på internationalt plan at
undersøge specielle variable DNA områder for at finde ligheder og forskelle
mellem plantefamilier og deres tilknyttede arter for at lave et stamtræ' over
planternes udviklingshistorie.
Det har vist sig de stykke af et DNA molekyle der ligger imellem kodende
områder (gener/gen-dele) variere mest fra art til art. For hver 500
bogstaver i disse områder vil der ca. ske een bogstavsombygning (mutation)
for hver 4 millioner år. Hvorimod ombytninger i et gen observeres 10 gange
s† sjældent, idet mutationen i et gen oftest er skadelig og vil forsvinde
hurtigt.
Hvis man er interesseret i at se DNA sekvensen (rækkefølgen af C,T,A,G)
imellem generne der koder for bestanddele af et ribosom (28SrRNA og 5SrRNA)
kan man finde DNA-sekvensen på foreningens HOMEPAGE på internettet (under
Taxonomi). Ca. 660 bogstaver er bestemt på 28 forskellige arter indenfor
lepidote og elepidote arter. Også mange andre planters DNA sekvenser i dette
område er offentliggjort.
Det viser sig at R. ponticum og R. argyrophyllums DNA er 99% ens i
bogstavrækkefølgen (-5 bogstaver), medens mellem ponticum og ferrugineum er
ligheden kun på ca. 96%, men mellem argyrophyllum og ferrugineum kun ca. 95%.
Deraf kan man slutte at argyrophyllum og ponticum er tættest beslægtet med
hinanden og argyrophyllum er mindre beslægtet med ferrugineum end ponticum.
Man kan yderligere slutte at alle de arter der har præcis samme
bogstavsombytninger må være meget tæt beslægtede. Der er desuden forskelle i
længden af genet, idet ferrugineum har mistet et bogstav i forhold til de to
andre elepidote. Interessant er at Ledum groenlandicum er næsten identisk (-
1 bogstav) med R. ferrugineum, hvilket medfører at Ledum groenlandicum bør
ændres til Rhododendron groenlandicum.
Arter som R. anthopogon, R. molle og især R. camtchaticum varierer mest fra
f.eks. R. ponticum.
Hans Eiberg
RHODODENDRONFAMILIENS STAMTRÆ 2
FRA RHODO-NYT 1997(1)
(Ovenfor) gennemgik jeg lidt basisorientering mht. opbygningen af
Rhododendron familiens stamtræ. Jeg har nu analyseret DNA sekvensen nøjere
fra flere arter og derved kunne lave et udbygget stamtræ (se andetsteds på
HOMEPAGEN). Sekvenserne er hentet over internettet fra en database over DNA
sekvenser, og kan nu ses på foreningens HOMEPAGE adresse:
(html://rclink.imbg.ku.dk/~he/rhodo.html)
Det er et forskerhold, hvor bl.a. D. Chamberlain (Edinburgh) indgår. De har
tænkt sig at analysere mindst 50 arter. Der er Ph.D. Roger Hyam der står for
arbejdet. Det er ikke en let opgave at konstruere et stamtræ i hånden og der
er da også lavet adskillige EDB-programpakker (PHYLIP, PAUP mm.) til dette
formål, hvilket jeg godt kan forstå. De fleste programmer kan dog kun
analysere få arter og korte sekvenser, hvis ganske almindelige IBM-PC
(pentium) anvendes og indenfor en rimelig tid. Jeg har derfor prøvet at
analysere sekvenserne fra 29 arter ved hjælp af computerpakken PHYLIP på en
"stor" SUN-Sparc 20 (det tog ca 2½ time). Sekvenserne for alle arter er
alignet (sat under hinanden og ordnet med evt. mellemrum, hvis der er
fjernet nogle bogstaver). Da jeg i første omgang kun analyserede 21 arter
kunne bl.a. R. albiflorum og R. schlippenbachii ikke sættes ind i stamtræet
med bestemthed alt efter hvilket program der anvendtes. R. camtschaticum
blev efter begge programmer nært beslægtede med R. canadense og R. luteum.
Efter jeg analyserede 28 arter og indlemmede Daboecia, blev langt flere
arter sat rigtig på plads (figur 2) og nu er kun R. moulmainense og R.
albiflorum forskelligt placerede i de to figurer.
688 bogstavers rækkefølge (kombinationer af ATCG) er bestemt omkring
genet for 5.8S rRNA. Jeg har indlemmet 24 arter på figur 1 (der er ikke
plads til de øvrige). Numrene i figuren betegner mutationer
(bogstavombytninger, fjernelser eller tilføjelser når 29 arter anvendes).
Numrene er afhængig af det aligmentsystem der er anvendt og ændres hele
tiden når nye arter indlemmes. Begge stamtræer er konstrueret efter det
princip at for ca. 100-200 millioner år siden havde forfædrene til
rhododendronfamilien en bestemt rækkefølge af bogstaver omkring genet for
5.8S rRNA. Der kan ske mutationer/ændringer i rækkefølgen og nogle af disse
ændringer nedarves fra generation til generation. Hvis nye arter opstår ud
fra få/enkelte planter ved en tilfældig isolation, kan alle dens
efterkommere få den pågældende mutation.
Eksempel på alignede DNA sekvenser (1-30) fra 5 arter.
1 5 15 16 30
R.ponticum TCGA-AACCTGCCAA CAAGCAGAAAACTTG
R.ferrugineum TTGA-AACCTGCCAA CAAGCAGAAAACTAG
L.groenlandicum TTGA-AACCTGCCAA CAAGCAGAAAACTAG
R.camtchaticum TCGA-AACCTGCCAA CAAGCAGAAAAGTTG
Daboecia TCGATAACCTG---A CGATCAGAAAAGTTG
De fremhævede bogstaver viser mutationerne. R.ferrugineum og L.groenlandicum
er helt ens og derfor tættest beslægtede.
Som det ses på figur 1 er der bevaret/overlevet ca. 7-20 mutationer per art
siden rhododendronfamilien er opstået.
For at være sikker på slægtskabet i den første periode må flere analyser dog
udføres. Hvor der kun er 1-2 mutation der adskiller to grene fra hinanden er
der stor usikkerhed og der er flere af sådanne i stamtræet. R. vaseyi som i
øjeblikket er klassificeret i familie med R. canadense er på figurene sammen
med R. albrechtii. Er R. camtschaticum en rhododendron? den er efter DNA
sekvensen tættere beslægtet med Irsk lyng (Daboeciai).
Hvad kan vi bruge stamtræet til? 1) Viden er altid rart at være i
besiddelse af og denne kan være med til at forklare evolutionen dvs. hvilke
planter der er nært beslægtede. 2) Kan forklare selve
artsdannelsesprocessen. 3) Kan give en tommelfingerregel mht. hvilke arter
der kan krydses og hvis de er langt fra hinanden vil mange af hybriderne
(hvis de kan laves) nok være svagelige. 4) Analysemetoden kan bruges til
artsbestemmelse, idet to planter der har væsentligt forskellig DNA-sekvens
må tilhøre to forskellige arter. 5) DNA-sekventering kan bruges til
faderskabsundersøgelse dvs. skelne mellem en hybrid og en art. Hybriden vil
have både faderens og moderens sekvens, som vil være forskellig. 6) Der kan
analyseres på et enkelt tørret blad og udfra DNA profilen kan planten
placeres i systematikken.
2) Artsdannelsesprocessen: Der er forskellige meninger omkring dannelsen af
nye arter. Nogle mener at nye arter dannes ved hybridisering mellem to
forskellige arter og efterkommerne herfra vil stabilisere sig til en art ved
selektion. Andre mener (inkl. undertegnede, som ikke er ekspert) at nye
arter dannes ud fra nye variationer indenfor samme art. Få planter er ophav
til en ny art der siden opformeres kraftigt under stadig selektion.
Artsdannelsen er en gradvis proces og en art er ikke konstant gennem tiden.
Hvis "hybridteorien" er den almindelig metode ved artsdannelsen vil det ikke
være muligt at konstruerer et stamtræ udfra variationen i eet lille gen, der
svarer til systematikken skabt udfra mange morfologiske karakterer. Fra
andre stamtræsundersøgelser fra andre plantegrupper er der i få tilfælde
fundet uoverensstemmelser (som måske ikke er det alligevel), men
"hybridteorien" er ikke den almindelige metode til artsdannelse. Der er
ingen fordel for to arter der har specialiseret sig til hvert sit miljø at
danne en hybrid. Hybrider og hybridsværme findes hyppigt i naturen, men de
overlever meget sjældent på lang sigt, også fordi de sætter færre frø end
arterne og derfor vil blive udkonkurreret. Under den danske ekspedition til
Sikkim så jeg eksempler på hybridsværme, som var ved at gå tilgrunde.
Områder med den gule R. thomsonii (R. thomsonii x R. campylocarpum F2), R.
decipiens (her R. wightii x R. hodgsonii) og R. sikkimense (R. arboreum x R.
thomsonii F2-?) blev kun holdt oppe ved omhyggelig pleje. 3) Hvis to arter
adskiller sig fra hinanden med mange mutationer så slægtskabet indbyrdes er
fjernt, så vil de ikke eller vanskeligt kunne krydses indbyrdes, da arterne
har nået at danne krydsningsbarrierer. Der kan dog også ske een enkelt
større kromosommutation (ombytning af større mængde materiale mellem to
kromosomer), dvs. en hurtig artsdannelse, som besværliggør en hybridisering
som folk mellem de meget tæt beslægtede arter Ledum/R. groenlandicum og R.
ferrugineum.
Usikkerheden mht. opbygningen af et stamtræ skyldes mange årsager. En af
dem er at der ofte er flere muligheder, der er lige sandsynlige, og der er
specielle bogstavskombinationer, der hyppigt muterer. En enkelt mutation,
hvor der er tilføjet 3 ekstra baser, kan opfattes som een, to eller tre
ændringer. En anden usikkerhed er at der er flere muligheder for at aligne
sekvenserne, som kan resulterer i forskellige placeringer af enkelte arter i
træet.
Som konklusion vil denne form for analyse revolutionere taxonomien og
sikre stamtræer vil blive konstrueret når der er analyseret 3-5 genområder
på måske 200 arter som repræsenterer alle serier. Især bliver det
interessant når flere af de problematiske arter indgår i analyserne.
Hans Eiberg